Espectrofotometría de absorción UV-visible
LA espectrofotometria se puede definir como cualquier técnica analítica que utiliza la luz para medir las concentraciones de soluciones, mediante la interacción de la luz con la materia.
La palabra espectro de origen griego se utilizó para nombrar rayos de luz porque en la antigüedad la gente enterraba a sus muertos en tumbas poco profundas, y el simple hecho de que alguien no se diera cuenta de pisar encima de una de estas tumbas provocaba la expulsión del gas metano, ya que los cuerpos en descomposición liberan varios gases, entre ellos el metano, que tiene la propiedad de autoinflamarse, presentando un aspecto luminoso intenso. Cuando alguien fue sorprendido por una bola gaseosa como esa, se asustó y dijo que estaba asustado por un fantasma, que en griego es espectro.
Fundación de la espectrofotometría
La luz en general se describe mejor como radiación electromagnética debido a su naturaleza dualista. Es decir, existe y tiene un comportamiento de campos eléctricos y magnéticos oscilantes como lo representa la siguiente figura:
Dónde:
La longitud de onda (λ) es la distancia, en metros, de un pico a otro de la onda;
A menudo (v) es el grado de oscilación de las ondas, en función de la velocidad de la luz en el vacío, que está representada por la constante C (c = 2.998×108metro. s-1). De modo que:
λ. v = c
Espectro electromagnético que representa las longitudes de onda correspondientes a cada radiación.
La técnica espectroscópica se basa en el aumento de energía en función del aumento de la frecuencia de la radiación incidente. Cuando una especie química absorbe energía en forma de fotones, sus electrones se excitan y se produce una transición de un orbital de menor energía a un orbital de mayor energía. Un ejemplo de esto son los compuestos químicos que tienen dobles enlaces C = C en benceno y C = O, carbonilo, por ejemplo.
Benceno
Cetonas de enlace peptídico
El aumento de energía está representado por la condición de frecuencia de Bohr:
E = hv
Dónde:
Y es la energía que aumenta en función de la frecuencia, y H es la constante de Planck h = 6.626×10-34js
La transición electrónica de los dobles enlaces se produce porque un doble enlace está formado por un orbital sigma (σ) y un orbital (π), de modo que el electrón que está en el orbital de enlace pi va al orbital pi que tiene mayor energía. (Para obtener más detalles, consulte la teoría de los orbitales moleculares). La transición en C = C y en C = O se representa en la siguiente figura, estas especies químicas se denominan cromóforos o sustancias que aportan el color:
Para C = C : π-π *
Para C = O: (orbital no enlazante) n-π *
Los aminoácidos como la Fenilalanina, la Tirosina y el Triptófano son los principales responsables de la absorción de luz de las proteínas porque tienen el anillo de benceno en su estructura química, además del enlace peptídico mencionado anteriormente. La luz se absorbe en el rango de 280 nm.
Ley de Lambert-Beer
La «fuerza vital» de la espectrofotometría se basa en la ley de Lambert-Beer, que establece:
«La absorbancia es directamente proporcional a la concentración de la solución de muestra».
O:
Registro (I / I0) = εcl
A = εcl
Dónde :
A es la absorbancia,
ε es el coeficiente de extinción molar y
l es la longitud del cubo.
Los principales componentes de un espectrofotómetro se presentan y sus respectivas funciones:
Fuente de luz: Está compuesto por una lámpara de deuterio y una lámpara de tungsteno (similar a una lámpara de automóvil). La lámpara de deuterio emite radiación UV y la lámpara de tungsteno emite luz visible.
Monocromador: algunos espectrofotómetros todavía tienen un prisma a modo de monocromador, pero los más modernos cuentan con dispositivos electrónicos que transforman la luz incidente en varias longitudes de onda, en una sola longitud, es decir, la luz monocromática.
Cubetas utilizadas en espectrofotometría. Por lo general, se utiliza una cubeta de 1 cm para facilitar los cálculos de la ley de Lambert-Beer.
Cubeta: es el recipiente adecuado para contener la muestra que se utilizará en el análisis, las cubetas pueden ser de cuarzo, vidrio y acrílico, pero se recomienda usar una cubeta de cuarzo porque el vidrio y el plástico absorben los rayos UV y provocan el reflejo de la luz visible.
Detector: el detector es un dispositivo que detecta la fracción de luz que ha pasado a través de la muestra y la transfiere a la pantalla y a la computadora conectada al dispositivo.
Análisis espectrofotométrico
Paso 1: la muestra debe prepararse rompiendo la muestra por métodos mecánicos, químicos o físicos;
Paso 2: la muestra se solubiliza en el disolvente elegido en un matraz aforado limpio y seco;
IMPORTANTE: el solvente la mayor parte del tiempo es agua, sin embargo, cuando se trata de muestras apolares que necesitan ser diluidas en solvente orgánico, nunca use alquenos, alquinos, cetonas o cualquier otro que tenga C = C o C = O o triples enlaces.
Paso 3: en una cubeta, el solvente puro se coloca y se lee a la misma longitud de onda que se leerá la muestra, este procedimiento se denomina lectura en blanco y tiene como objetivo minimizar los errores causados por la absorción de luz causada por el vidrio y el agua;
Paso 4: la muestra se filtra a través de una membrana de 0,2 μm, debido a que la solución debe ser completamente transparente para reducir al máximo el error causado por las partículas en suspensión, la cubeta que contiene el blanco y se retira del equipo y se anota su absorción. Después de este proceso, se lee la solución de interés y se resta la lectura del blanco de esta absorbancia.
Cuidado de la espectrofotometría
- Es fundamental que el equipo sea calibrado y manipulado de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pues ya trae el margen de error que tiene el dispositivo;
- Para evitar errores de lectura, asegúrese de que el equipo esté cerrado. Antes de leer, la luz ambiental puede interferir con el resultado;
- Mantener siempre limpio y cerrado para evitar la acumulación de partículas de polvo que interfieran con el análisis. En ningún caso tocar la cubeta con las manos desnudas, nuestra mano contiene grasa e interfiere con la lectura.
- Solo los compuestos que absorben la luz pueden analizarse mediante espectrofotometría de absorción.
- En el caso de soluciones muy coloreadas como permangantes, complejos muy coloreadas, dicromatos, cromatos y otros compuestos con colores muy acentuados, se deben realizar al menos 5 diluciones de concentración conocida y leerlas en el espectrofotómetro y se debe trazar una curva analítica para determinar el coeficiente de extinción molar. Las soluciones muy concentradas tienden a provocar errores de lectura porque hay demasiadas moléculas juntas.
Bibliografía:
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Lenhinger, Albert Lester; Principios de bioquímica.3.ed. Guanabara Koogan, Río de Janeiro: 1992. cp.3.
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Jones, Loretta; Atkins, Peter Principles of Chemistry – Cuestionando la vida moderna y el medio ambiente – 3rd Ed-Porto Alegre: Bookman, 2006.
