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Técnica de análisis químico utilizada para separar los constituyentes de una mezcla.
1. Principio de la cromatografía
El principio de la cromatografía se basa en las diferencias de afinidad de los compuestos de una mezcla entre una fase móvil y una fase fija. Más concretamente, los diversos constituyentes de la mezcla son arrastrados por la fase móvil y se separan gradualmente en la fase fija (o estacionaria) según su adsorción o su solubilidad (→ solución), según la técnica cromatográfica utilizada.
La fase móvil puede ser un líquido (entonces se llama eluyente), o un gas (entonces se llama gas portador).
La fase fija puede ser sólido (gel de sílice, alúmina, etc.) o líquido.
Cada constituyente de la mezcla estudiada tiene una velocidad de migración característica que permite separarlo de los demás y así identificarlo. En general, la muestra se analiza por comparación con sustancias ya conocidas en la muestra. El diagrama obtenido por cromatografía se llama cromatograma y traduce la variación del compuesto estudiado (especies minoritarias) en la fase móvil (eluyente o gas portador) en función del tiempo.
2. Los diferentes tipos de cromatografía
Las diferentes técnicas cromatográficas se pueden clasificar en términos generales en dos familias principales: cromatografía en fase líquida y cromatografía en fase gaseosa.
2.1. Cromatografía en fase líquida (PLC)
Existen diferentes tipos de cromatografía en fase líquida según el método de separación utilizado.
cromatografía de adsorción
El aparato consta de una columna cromatográfica (de vidrio o de acero inoxidable), llena de partículas sólidas de un diámetro inferior a 20 µm (generalmente alúmina o gel de sílice). Por la parte superior de la columna se introducen algunos microlitros de la solución a analizar. Los constituyentes separados a la salida de la columna se detectan por espectroscopia UV o por refractometría.
Como su nombre indica, esta cromatografía se basa en la adsorción selectiva de constituyentes líquidos sobre la fase sólida de la columna. De hecho, se produce una sucesión de adsorciones y desorciones, esta última provocada por la adición de un disolvente al final de la separación.
Cromatografía de partición líquido-líquido
Esta técnica cromatográfica utiliza la diferencia de solubilidad (→ solución) de los constituyentes con respecto a dos líquidos inmiscibles.
Exclusión por tamaño o cromatografía de permeación en gel (GPC)
La cromatografía de exclusión utiliza la diferencia de penetración de los constituyentes en un gel polimérico. A medida que pasan a través de la columna, solo las moléculas cuyo diámetro es inferior a cierto valor pueden penetrar en los poros del gel. Los compuestos se separan así según el tamaño de sus moléculas.
cromatografía de intercambio de iones
Esta técnica cromatográfica utiliza el intercambio de iones entre la fase fija (resina formada por iones) y la fase móvil previamente ionizada. Los iones son generalmente ácidos, bases o cationes metálicos. La cromatografía de intercambio iónico se utiliza para sustancias ionizables, particularmente en química mineral.
Cromatografía en papel
En la cromatografía en papel, la mezcla a analizar se disuelve previamente. Se coloca una gota de esta mezcla líquida sobre una hoja de papel. El disolvente migra por capilaridad, arrastrando consigo los diferentes constituyentes de la mezcla, que se detienen más o menos lejos de la mancha formada por la gota inicial según su interacción con la celulosa del papel.
Cromatografía en capa fina (TLC)
La cromatografía en capa fina, estudiada en la escuela secundaria, es muy similar a la cromatografía en papel, la fase fija es una capa delgada de adsorbente (generalmente sílice) depositada en una placa de vidrio. La mezcla a estudiar se deposita mediante un capilar aproximadamente a un centímetro del borde, luego se coloca en un tanque que contiene el eluyente. El eluyente migra sobre la placa de sílice por capilaridad y arrastra los compuestos de la mezcla estudiada, que se separarán si tienen distintas velocidades de migración. Luego, la placa de cromatografía se lee directamente si los compuestos son visibles o se coloca bajo luz ultravioleta (UV).
El principal interés de TLC es la identificación rápida de compuestos en una mezcla, pero esta técnica no permite la determinación de un compuesto.
Cromatografía líquida de alta presión/rendimiento (HPLC)
La cromatografía líquida de alta presión (también llamada cromatografía líquida de alta resolución) está reemplazando cada vez más a la cromatografía líquida en columna por percolación simple a presión atmosférica, debido a su baja tasa de elución. De hecho, la técnica de HPLC permite utilizar fases estacionarias con un tamaño de partícula mucho más fino (de 3 a 10 μm) pero que requieren una presión de entrada a la columna que puede llegar hasta los 400 bares.
Esta técnica se ha convertido así en una de las más utilizadas en los laboratorios de análisis químico por su extrema precisión, que permite encontrar compuestos traza. Junto con un método de detección adecuado (un espectrómetro de masas, por ejemplo), esta cromatografía de flujo impuesto permite la identificación y cuantificación de una amplia variedad de compuestos orgánicos o inorgánicos.
2.2. Cromatografía de gases (GC)
La cromatografía de gases permite separar mezclas de gases o compuestos que pueden vaporizarse a alta temperatura. La mezcla a analizar se inyecta en una columna metálica de unos pocos milímetros de diámetro que contiene la fase fija. Los compuestos son transportados bajo presión por un gas (conocido como gas portador). Suele ser helio (He), argón (Ar) o nitrógeno (N2).
El tiempo que tarda un constituyente gaseoso en recorrer la columna es su tiempo de retención, que es característico del compuesto. Los constituyentes se separan así por la diferencia entre sus respectivos tiempos de retención.
La elección de la fase fija es decisiva para el éxito de la separación. Esta fase se elige en función de su porosidad y de sus interacciones con la fase móvil, que dependen en particular de la diferencia de polaridad entre las dos fases.
La cromatografía de gases es un medio muy eficiente de separación. Se utiliza en particular en refinerías y en la industria química. Se puede combinar con un espectrómetro de masas para identificar los compuestos de la mezcla vaporizada a medida que eluyen.
3. Historia y aplicaciones de las cromatografías
La cromatografía fue inventada en 1906 por el botánico ruso Mikhail Tsvet, quien buscaba separar los pigmentos de las plantas. En particular, había observado la separación de los constituyentes coloreados de la clorofila cruda (que contiene clorofilas ayb, carotenos y xantofila → carotenoide) cuando su solución ascendía a lo largo de un papel de filtro. De hecho, los diferentes constituyentes formaron bandas de distintos colores a diferentes alturas. Pero no fue hasta la década de 1930 que la cromatografía se utilizó más ampliamente en diferentes campos.
Hoy en día, las técnicas cromatográficas están omnipresentes en muchos sectores de actividad. Forman parte de las técnicas esenciales utilizadas tanto en los laboratorios de investigación (química, bioquímica, medicina, toxicología, prevención del fraude, etc.) como en la industria química, paraquímica (cosmética, productos fitosanitarios, perfumes, polímeros, etc.) y farmacéutica. Esta generalización del uso de la cromatografía está ligada por un lado a razones económicas (su coste relativamente bajo) y por otro lado a sus innegables ventajas: rapidez de ejecución y análisis cualitativo y cuantitativo de pequeñas cantidades de muestra.
